Schizosaccharomyces pombe különleges Hal3 génjének vizsgálata

A gomba-specifikus Ser/Thr protein foszfatáz Z (PPZ) jellegzetes inhibitora a Hal3. A jól ismert S. cerevisiae Hal3 fehérjével homológ szekvenciákat bioinformatikai módszerekkel keresve két olyan különleges organizmust találtunk (S. pombe és S. japonicus) melyekben a HAL3 ORF 5’-fele nagy hasonlóságot mutatott az S. cerevisiae HAL3 (ScHAL3) génjével, míg 3’-fele a timidilát szintáz génhez hasonlít. Mivel más élőlényben ilyen különleges fúziós gént még nem találtak először ellenőriztük a gén szekvenciák helyességét. Az általunk meghatározott DNS szekvenciák (egy csendes mutációt kivéve) megegyeztek az adatbázisban találtakkal. A szekvenálási hiba kizárása után molekuláris genetikai módszerekkel tanulmányoztuk a moduláris felépítésű S. pombe HAL3 (SpHAL3) funkcióját. Ehhez a teljes SpHal3 fehérjét illetve csak a ScHal3 fehérjével homológ N-terminális szakaszát (SpHal3-Nter) expresszáló vektorokat állítottunk elő, és ezeket hal3 hiányos vagy MAP kináz (slt2) hiányos S. cerevisae deléciós mutánsokba transzformáltuk. A heterológ rekombináns fehérjék expresszióját Western blottal bizonyítottuk.
Először a transzformált hal3 sejtek só (NaCl, LiCl) és toxikus kation (spermin, TMA, higromicin) tűrését vizsgáltuk. Azt kaptuk, hogy a SpHal3-Nter expressziója, a ScHal3-hoz hasonló módon, de kisebb mértékű toleranciát okozott LiCl, NaCl és toxikus kationok jelenlétében. Ezzel szemben a teljes hosszúságú SpHal3 expressziója nem okozott változást. Ezután a slt2 hiányos mutánsokban a sejtfal integritánst teszteltük. Ismeretes, hogy a slt2 sejtek hajlamosak lízisre, és érzékenyek a sejtfalat károsító anyagokra (koffein). A ScHal3 fehérje túltermelésekor az slt2 mutánsokban erősödött a lítikus fenotípus, a sejtek koffein érzékenysége nőtt. Várakozásunkkal ellentétben sem a teljes SpHal3 sem a rövidebb SpHal3-Nter overexpressziója nem fokozta a koffein érzékenységet.
Eredményeink azt mutatják, hogy a különleges S. pombe SpHal3 fehérje nem tudja átvenni a S. cerevisiae ScHal3 funkcióit, bár a szerkezetileg konzerválódott N-terminális szakasza részben képes a ScHal3 hiányát kompenzálni.

A Barcelonai Autonóm Egyetemen végzett munkámat az ERASMUS és a Libra alapítvány támogatta.