A miozin foszfatáz kölcsönható fehérjéinek és szabályozásának vizsgálata B50 neuroblastoma sejtekben

A neurotranszmitterek felszabadulását a fehérjék reverzibilis foszforilációja is szabályozza. A neuronális fehérjék foszforilációs szintjét a protein kináz és foszfatáz enzimek határozzák meg, azonban a jelátviteli folyamatokban résztvevő enzimek és szabályozási mechanizmusuk még nem minden részletében ismert. A miozin foszfatáz (PP1M) protein foszfatáz 1 (PP1) katalitikus alegységet (PP1c) és miozinhoz is kötődő 133 kDa regulátor alegységet (MYPT) tartalmaz, szerepét eddig elsősorban a kontraktilitás szabályozásában tanulmányozták. A PP1M idegrendszerben betöltött szerepét előzetesen szinaptoszóma preparátumon vizsgálták, ám azok rövid életideje egy új modellrendszer keresése ösztönöztek minket. Ezért célul tűztük ki a PP1M enzim lokalizációjának, szabályozó- és élettani szerepének vizsgálatát a B50 neuroblasztóma sejtvonalon.
A PP1M alegységeinek és az enzimet szabályozó Rho-A aktivált kináz (ROK) jelenlétét kimutattuk B50 sejtekben Western blot analízissel és immunfluorszcenciás vizsgálatokkal. Immunprecipitációval bizonyítottuk a MYPT asszociációját ROK-kal, a PP1c izoformáival, valamint a neurotranszmitter kibocsátásban kulcsszerepet játszó SNARE komplex elemeivel, így a szinaptofizin, SNAP25, synapsin és syntaxin fehérjékkel is. A ROK és a PP1M szubsztrátfehérjéinek azonosítására B50 lizátumban foszforilációs kísérletet végeztünk Y27632 (ROK inhibitor), valamint TMC (a PP1 inhibitor) jelenlétében. Sikerült bizonyítanunk a synapsin Ser14, illetve a syntaxin Ser9 aminosav-oldalláncon történő ROK/PP1 általi szabályozását, valamint a ROK gátló hatását a PP1M-re foszfospecifikus antitestekkel. Az Y27632 és TMC inhibitorok csökkentették a B50 sejtek MTT vizsgálattal mért életképességét és a B50 sejtlizátumban mért PP1 enzimaktivitást.
A PP1M kölcsönható- és szubsztrátfehérjék az axon elongációban, elaborációban, neurotranszmitter felszabadulásban és a szinaptikus vezikulumok szállításában játszanak szerepet, ami a PP1M és a ROK fontos szerepére utal a szinaptikus fehérjék foszforilációs szintjének kialakításában és a neurotranszmitter kibocsátás szabályozásában (Bolyai Ösztöndíj Alapítvány, OTKAK68416).